在生物制品和細胞治療領(lǐng)域，支原體檢查是保證產(chǎn)品和治療安全的重要一環(huán)。生物源性原材料、采用細胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體，以及細胞或基因治療產(chǎn)品在生產(chǎn)過程的不同階段都要進行支原體污染的檢查。

傳統(tǒng)支原體檢查方法是培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法，并為藥典所認(rèn)可和收錄。近年來，『支原體qPCR檢測』在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，但在項目申報前，先需要進行方法學(xué)驗證，依據(jù)藥典，在檢測限、特異性和耐用性方面達到要求后，才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。

就筆者所知，在適合工業(yè)的支原體檢測和方法驗證方面，德國Minerva Biolabs（簡稱MB）公司已有很成熟的產(chǎn)品及商業(yè)化應(yīng)用，它不僅提供有符合藥典的『支原體qPCR檢測』試劑盒，而且有一系列支原體標(biāo)準(zhǔn)品及輔助產(chǎn)品，用于qPCR方法的全面驗證。這些產(chǎn)品性價比也較高，許多客戶都在使用。

下面，筆者就『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』的方法驗證產(chǎn)品闡述如下。

 

一、『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求

各國藥典對支原體核酸擴增檢測方法（簡稱NAT法）的驗證要求略有出入，但均要求對檢出限、特異性和耐用性進行驗證。在檢測方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進行支原體檢測。

如使用商品化試劑盒，則除了需要試劑盒生產(chǎn)商提供完整的方法學(xué)驗證數(shù)據(jù)外，還需要使用者驗證試劑盒對其樣本的適用性，以及試劑盒表現(xiàn)出預(yù)期的性能（例如檢測限、耐用性、是否存在與細菌的交叉反應(yīng)）。這些必須由使用者自己來證明。

在檢出限驗證中，歐洲藥典（簡稱EP）規(guī)定了污染細胞的常見9種支原體，要求NAT如替代培養(yǎng)法，對這9種支原體的檢測限需均達到10CFU/ml。其中如果生產(chǎn)中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關(guān)節(jié)液支原體（M. synoviae）。

日本藥典（簡稱JP）中的驗證要求與EP基本一致，但在檢出限驗證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗證。

終待驗證的支原體物種的選擇，在依據(jù)藥典基礎(chǔ)上，還需根據(jù)支原體污染風(fēng)險大小而定。污染風(fēng)險的影響因素有支原體寄生的宿主細胞的特異性、原材料的來源、產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域等。

德國MB公司提供有10CFUTM支原體高敏標(biāo)準(zhǔn)品，可同時用于檢測限和耐用性的驗證。

 

關(guān)于檢測限和耐用性的檢測次數(shù)，有如下公式可參考：

檢測次數(shù) = 支原體物種數(shù) × 3 輪獨立檢測 × 8個復(fù)孔/每個物種/每輪

以歐洲藥典規(guī)定的9種支原體為例，實際所需檢測次數(shù)為9 × 3 × 8 = 216 次檢測。

加上陰性對照、陽性對照、無模板對照以及特異性驗證，預(yù)計規(guī)格為250次/盒的試劑盒較為適合。

在NAT法的特異性驗證方面，歐洲藥典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系，應(yīng)優(yōu)先選擇進行驗證。

至于更具體的驗證方案，還需要使用者針對自己的產(chǎn)品以及流程自行設(shè)計，德國MB公司也可協(xié)助完善。

二、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』方法的驗證產(chǎn)品

下面列出的方法驗證所需產(chǎn)品，具體有四個表，供使用者參考：

表1.『支原體qPCR檢測』方法驗證所需產(chǎn)品

 

表2. 特異性驗證用標(biāo)準(zhǔn)品

根據(jù)EP2.6.7，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系，適合用于特異性驗證。因此下表列出的是這3個菌屬的產(chǎn)品。用戶也可選擇自己生產(chǎn)過程中可能會遇到的細菌進行特異性驗證。

 

表3. 其他輔助產(chǎn)品

 

表4. qPCR方法驗證所需設(shè)備、儀器

 

希望以上信息能給您帶來幫助。

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